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    你不得不收藏的抗體偶聯物選擇指南

    發表時間:2022-05-12  |  點擊率:520

     

     

    免疫學實驗已經成為蛋白質科學研究領域難以替代的重要實驗方法。通過將“可以與待測分子結合的特異性抗體”和“易于被檢測到的標記物”二者相偶聯的方法,研究人員已經獲得了高效且特異檢測樣本中靶標的有效工具。而且隨著檢測手段的更新迭代,越來越多的標記物類型也花樣翻新,大有“亂花漸欲迷人眼”之勢。那么,如何才能在種類繁多的抗體偶聯物中找到合適自己的那一個呢?今天就讓我們為你撥開迷霧,一探究竟。

     


    其實,作為標記的偶聯物種類雖多,但其實The commonly used偶聯物只有3個大類,即:酶標記、熒光標記和生物素標記。

    酶標記的The preferred毫無疑問是辣根過氧化物酶 (HRP) 。HRP能通過催化有過氧化氫參與的一系列氧化還原反應并釋放信號,而被廣泛應用于免疫印跡 (WB), 酶聯免疫吸附 (ELISA), 以及免疫組織化學 (IHC) 等實驗中。由于HRP自身穩定性強且催化效率高,因此可以通過很簡單的操作,有效放大中低豐度靶標的信號,因此能夠適應大多數檢測情境。酶標記中的另外一種是堿性磷酸酶 (AP) 標記,常常是通過催化磷酸酯底物的去磷酸化顯色反應而達到檢測目的。與HRP相比,AP標記過程中酶活性損失更大、穩定性低且反應時間長,因此對制備和檢測操作都提出了較高要求。但是得益于AP獨特的最適pH和催化穩定性,這使得AP在堿性條件或對結果穩定性要求苛刻的特殊場合下,具有比HRP更好的工作性能。

    HRP標記往往是樣本單靶點檢測的The preferred,但當需要對同一樣本中的多個靶點進行多通道檢測時,熒光標記抗體則提供了一種更好的選擇。各類熒光標記,如:AF系列、Cy系列、FITC、羅丹明等為研究人員們提供了極大地選擇空間,因此被廣泛應用于免疫熒光染色 (IF), 流式細胞術 (FC), 和熒光免疫印跡 (FWB)實驗中。選擇熒光標記時,熒光相對強度和光譜分離度的選擇尤為重要。由于激光光源、檢測設備等的不同,不同的熒光標記在不同的設備上具有不同的熒光強度。因此,選擇熒光標記物時,需要結合實驗室設備的特點和蛋白豐度,確保最亮的標記物和表達水平The minimum的蛋白相互組合。此外,“串光”問題會在熒光實驗中帶來非常大的不利影響,并直接影響結果的可信度。因此,熒光標記物發射光譜應盡可能地彼此遠離,以避免鄰近通道間熒光信號的串擾。如果難以確認最佳熒光標記的種類,優先去嘗試AF488, Cy5, FITC, PE等文獻中The commonly used到的熒光標記通常是較為穩妥的選擇。

    和熒光與酶標記不同,生物素標記由于不能直接釋放信號而很少被獨立使用,但是卻常出現在各類免疫學實驗應用場景中。得益于生物素與各類親和素高特異性且強力地結合,生物素標記抗體可以添加在原有的一抗和二抗之間(此時生物素化抗體成為二抗,而原先的二抗被三抗或標記的親和素取代),隨后被標記親和素和生物素標記的結合,可以使低豐度靶標的信號被進一步放大,進而提升檢測的信噪比。因此,當我們關心的靶蛋白豐度過低,以至于傳統的標記物難以對其進行有效的檢測時,生物素化抗體往往能力挽狂瀾,成為我們實驗成功的一根救命稻草。如果與時下流行的酪胺信號放大技術 (TSA) 相結合,生物素化抗體甚至能為我們提供清晰而明亮的熒光成像。

    好的開始是成功的一半,辛苦實驗的你不需要為選擇標記抗體而苦惱。給博奧森一份信任,我們還你的不只是一支好抗體!



     

     

     

     

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